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Analisi di Next Generation Sequencing nel Colangiocarcinoma Intraepatico in base alla stratificazione per fattori di rischio: Studio Etherbil

Il Colangiocarcinoma (CC) è una neoplasia che origina dall'albero biliare e rende conto di oltre il 25 % dei tumori primitivi del fegato. Si distinguono una forma intra-epatica (ICC), che si sviluppa a carico delle vie biliari all'interno del parenchima epatico, e una forma extra-epatica, che origina a carico delle vie biliari al di fuori del fegato. Negli ultimi trent'anni, su scala mondiale, è stato osservato un progressivo aumento d'incidenza, prevalenza e mortalità della forma intra-epatica, mentre i corrispettivi tassi della forma extra-epatica sembrano essere stabili o in leggera riduzione (1). Tale incremento non sembra ancora aver raggiunto un plateau e sembra essere un fenomeno reale, piuttosto che la conseguenza del miglioramento nelle tecniche diagnostiche, giustificando così la crescente attenzione verso le cause di questa neoplasia. Si ritiene, infatti, che le variazioni geografiche d'incidenza tra ICC e ECC possano riflettere una diversa distribuzione dei fattori di rischio associati a queste due forme, suggerendo pertanto una segregazione spazio-temporale dei potenziali fattori carcinogenetici. Allo stato attuale, alcune patologie delle vie biliari caratterizzate da infiammazione cronica, quali la colangite sclerosante primitiva, l'epatolitiasi, le cisti coledociche e le infezioni epatiche da parassiti, sono state riconosciute come fattori di rischio dell'ICC. Tuttavia, tali fattori di rischio sono identificabili in circa un terzo dei pazienti con diagnosi di ICC, mentre nei restanti due terzi dei casi l'eziologia di questa neoplasia rimane sconosciuta (2, 3). E' quindi ipotizzabile che altri fattori, al momento non ancora noti, possano essere responsabili del recente aumento di ICC.

L'amianto è un minerale naturale che nel corso dell'ultimo secolo è stato largamente impiegato in ambito industriale. Oggigiorno, è stato bandito in 52 paesi (inclusi tutti gli Stati membri dell'Unione Europea), a causa della provata associazione tra l'esposizione a questo composto e lo sviluppo del mesotelioma maligno e del tumore del polmone (4).

In un recente studio caso-controllo condotto dal nostro gruppo, abbiamo osservato un rischio di sviluppo di ICC superiore di oltre quattro volte nei lavoratori esposti a questa sostanza (5). Questi risultati suggeriscono fortemente che l'amianto possa essere implicato anche nella patogenesi dell'ICC. Sulla base della possibile relazione tra esposizione all'amianto e sviluppo dell'ICC dovremmo aspettarci, come nel caso del mesotelioma, un rapido incremento di casi di ICC nei prossimi anni, a causa della diffusione massiccia di questa sostanza nell'ambiente negli ultimi decenni, prima che ne fosse vietato l'impiego.

In questo contesto, il presente studio si propone di identificare, mediante tecnologia di next generation sequencing (NGS), possibili marcatori molecolari in pazienti con ICC esposti all’amianto e/o ad altri fattori di rischio ad oggi riconosciuti per tale neoplasia.

Disegno dello studio

L’arruolamento dei pazienti eleggibili per lo studio verrà effettuato secondo i seguenti criteri:

• Criteri di inclusione:

1) pazienti  di eta’ superiore ai 18 anni, con sospetta diagnosi di ICC candidati a biopsia epatica per conferma diagnostica e/o pazienti con ICC accertato candidati a chirurgia ad intento curativo, esposti e non esposti all'amianto (in accordo con il questionario del Registro Nazionale del Mesotelioma), in presenza/assenza di altri fattori di rischio noti per l’ICC; 2) ottenimento del consenso informato del paziente per l'uso del campione a scopo di ricerca, inclusa l'analisi del genoma.

• Criteri di esclusione:

1) qualunque trattamento medico (chemioterapico sperimentale o standard) o radioterapico intrapreso nei 5 anni precedenti all’ingresso nello studio.

Sulla base del numero di pazienti che ogni anno vengono seguiti dal nostro Centro, prevediamo di arruolare in questa fase di discovery dello studio un totale di 45 casi di ICC. Per ciascun paziente arruolato saranno raccolti campioni di fegato sano e di tessuto tumorale, o durante la biopsia epatica eco-guidata normalmente eseguita nel percorso assistenziale di routine per la diagnosi istologica, o sul pezzo operatorio dopo intervento chirurgico a scopo curativo. Una parte del campione verra’ impiegata per la ricerca delle fibre di amianto. Un’altra parte verra’ utilizzata per l’analisi molecolare mediante exome sequencing e RNAseq, al fine di individuare eventuali varianti a singolo nuclotide (SNVs), trascritti di fusione e variazioni di espressione genica, utilizzando la piattaforma Illumina HiscanSQ. Per ciascun paziente verra’ inoltre prelevato un campione di sangue periferico per lo studio delle mutazioni somatiche o germinali.

Sulla base della distribuzione delle fibre di amianto, la popolazione di studio verrà suddivisa in due gruppi: soggetti con medio/alto carico di fibre di amianto per unità di tessuto epatico (definiti esposti) e soggetti con carico basso o nullo (definiti non esposti). Il cut-off da utilizzarsi per distinguere i due gruppi (esposti/non esposti) verrà stabilito sulla base della distribuzione statistica delle concentrazioni di fibre di amianto nel tessuto epatico nella popolazione oggetto dello studio. L' analisi bioinformatica dei dati di NGS verra' effettuata mediante l'utilizzo di Server CentOS5 e si suddividerà in due fasi. Nella prima fase verranno individuati i segnali che si discostano significativamente dalla distribuzione attesa delle SNVs nella popolazione generale.

Nella seconda fase si analizzerà la presenza di clustering per il gruppo di geni selezionati. Per valutare l’espressione genetica nei due gruppi studiati (esposti e non esposti) verrà eseguita una two-way unsupervised hierarchical cluster analysis. Verrano inoltre condotti dei random permutation test per valutare formalmente la presenza di geni la cui espressione è diversa nei due gruppi.

Obiettivi e risultati attesi

L'obiettivo di questo studio è l'identificazione di possibili marcatori molecolari di ICC indotto dall’esposizione all’amianto in relazione anche alla presenza/assenza di altri fattori di rischio ad oggi noti per tale neoplasia. L’ICC, avendo diversi fattori di rischio accertati, costituisce infatti un modello ideale per valutare il peso differenziale di questi fattori, incluso l’amianto, nello sviluppo della malattia.

L’identificazione di possibili “firme” genetiche associate ai diversi fattori di rischio per l’ICC consentirebbe: a) di ottenere nuove informazioni riguardo ai meccanismi patogenetici alla base dell’ICC e di sviluppare conseguentemente strategie personalizzate, stratificate e piu' efficaci per la prevenzione e il trattamento di questa neoplasia mediante l'utilizzo di farmaci specificamente diretti contro le vie patogenetiche individuate; b) di facilitare in futuro le procedure di sorveglianza in coorti di soggetti che siano stati esposti ai diversi fattori di rischio per tale neoplasia.

I risultati ottenuti in questa fase di discovery, utilizzando NGS, saranno da considerarsi come preliminari ad uno studio futuro condotto su un numero piu’ ampio di pazienti, impiegando sanger sequencing gene target su un dataset di casi prevalenti.

 References

 1. Hammill CW, Wong LL. Intrahepatic CC: a malignancy of increasing importance. J Am Coll Surg. 2008; 207(4): 594-603.

2. Alvaro D, et al. Descriptive epidemiology of CC in Italy. Dig Liver Dis. 2010; 42(7): 490-5.

3. Tyson GL, El-Serag HB. Risk factors for CC. Hepatology. 2011; 54(1): 173-84.

 4. Becklake MR, et al. Asbestos-related diseases of the lungs and pleura: uses, trends and management over the last century. Int J Tuberc Lung Dis. 2007; 11(4): 356-69. 

5. Brandi G, et al. Asbestos: a hidden player behind the cholangiocarcinoma increase? Findings from a case-control analysis. Cancer Causes Control. 2013; 24(5):911-8.

Responsabile dello studio:

  • Prof Giovanni Brandi

Collaboratori:

  • Dott.ssa Simona Tavolari
  • Dott.ssa Marzia Deserti
  • Dott.ssa Annalisa Astolfi
  • Dott.ssa Valentina Indio
  • Dott. Francesco Vasari
  • Dott. Andrea Farioli
  • Dott . Jody Corbelli
  • Dott Andrea Palloni
  • Dott. Giorgio Frega
  • Dott Aurelia Barbera
  • Dott.ssa Stefania de Lorenzo