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Analisi di Next Generation Sequencing in pazienti affetti da Adenocarcinoma Duttale del Pancreas e Lesioni Precancerose (IPMN): Studi Genopan II e III

Nell’ambito del finanziamento ottenuto grazie al Programma di Ricerca Regione Università  2013 – Area 1 “Ricerca Innovativa”, Bando “Alessandro Liberati” – Giovani Ricercatori, progetto “Whole-tanscriptome paired-end sequencing in pancreatic cancer and precursor lesions: from early detection to therapeutic implications”. Coordinatore Scientifico: Dott.ssa Silvia Vecchiarelli.

L’adenocarcinoma duttale del pancreas e le sue lesioni precancerose, quali le Neoplasie Intraduttali Papillari Mucinose (IPMN), si sviluppano attraverso una serie di alterazioni genomiche ed epigenetiche complesse che rendono ragione dell’estrema eterogeneità clinica e biologica di questa malattia. Recentemente è stato dimostrato che le cellule impiegano 11 anni per sviluppare capacità invasive. Ciò potrebbe potenzialmente permettere di intervenire precocemente sulle lesioni precancerose se evidenziabili clinicamente [1]. Le IPMN sono infatti lesioni cistiche pancreatiche, evidenziabili radiologicamente in fase precoce, che prendono origine dai dotti pancreatici (principale-tipo I; secondari-tipo II o entrambi- tipo III), associate a vari gradi di displasia, con potenziale rischio di evoluzione maligna, sebbene la storia naturale ed il rischio di cancerizzazione non siano ad oggi ancora ben delineati. Ciò che è ben noto è che se correttamente trattate le IPMN hanno una buona prognosi [2].

L’adenocarcinoma duttale del pancreas, nonostante i recenti progressi sui trattamenti chemioterapici, rappresentati dall’introduzione dello schema terapeutico FOLFIRINOX e di un nuovo farmaco, il  Nab-paclitaxel, è tuttora caratterizzato da una cattiva prognosi, rappresentando la quarta causa di morte per cancro nel mondo: negli USA l’incidenza stimata nel 2013 è stata di 45.220 nuovi casi con 38.460 decessi [3][4][5].

L’alto tasso di mortalità è dovuto prevalentemente ad una diagnosi tardiva ed all’assenza di terapie mediche efficaci  per pazienti affetti da malattia in stadio localmente avanzato o metastatico. Nonostante negli ultimi anni siano stati fatti notevoli sforzi volti alla comprensione molecolare di questa patologia e sul processo di cancerogenesi, l’impatto clinico sul trattamento e sulla diagnosi precoce resta limitato.

Negli ultimi anni, grazie allo sviluppo delle tecnologie di sequenziamento massivo del genoma di nuova generazione, sono stati fatti importanti progressi sulla conoscenza molecolare di questa patologia [6][7]. Sono state descritte le mutazioni costitutive dell’adenocarcinoma pancreatico, quali KRAS (90%), CDKN2A (95%), TP53 (50-75%) e SMAD4 (50%), tuttavia la problematica principale riscontrata in letteratura è l’estrema varietà nello spettro di mutazioni dell’adenocarcinoma pancreatico, che varia da paziente a paziente, e rende di difficile individuazione potenziali markers predittivi di diagnosi precoce e bersagli molecolari utili per lo sviluppo di terapie target [8][9][10].

E’ infatti oramai accertato che sono almeno 12  le principali vie di trasduzione del segnale implicate nel processo carcinogenetico del cancro del pancreas (K-Ras, TGFβ, Wnt/Notch, Hedgehog ecc), che si intersecano in un complesso network. Le alterazioni genetiche riconosciute a carico di tali pathways sono responsabili della neoangiogenesi, dell’aberrante espressione di proteine sulla superficie cellulare, della disregolazione del ciclo cellulare, delle alterazioni del citoscheletro e soprattutto delle alterazioni dei meccanismi di riparazione del DNA [11][12][13][14].

Tuttavia ad oggi non sono state individuate le tappe fondamentali del processo di cancerogenesi, crescita e metastatizzazione. Alcuni studi hanno analizzato l’adenocarcinoma pancreatico con i suoi precursori, sia IPMN [15][16], che neoplasie intraepiteliali (PanIn) [17][18], confermando di fatto la presenza di cloni metastatici preesistenti alle lesioni francamente maligne [19][20]. In particolare, un recente studio ha evidenziato che le IPMN nel 96% dei casi mostra una mutazione di GNAS o KRAS, e più di un terzo le possiede entrambe. Pertanto GNAS ed altri markers molecolari sono tutt’ora oggetto di studio come potenziali marcatori biologici di diagnosi precoce di carcinoma invasivo e displasia [21][22].

Nonostante siano stati fatti notevoli passi avanti, le conoscenze riguardo alla biologia del carcinoma del pancreas non sono sufficienti per una ipotizzabile applicazione in campo clinico e molte questioni rimangono oggetto di studio, con particolare attenzione ai potenziali marcatori biologici predittivi che permettano una diagnosi precoce, una miglior definizione prognostica e/o di risposta ai trattamenti chemioterapici.

Scopo dello Studio

Lo studio si propone l’identificazione di possibili  alterazioni genetiche che caratterizzano l’evoluzione da IPMN ad adenocarcinoma pancreatico invasivo. Si precisa che per i tessuti necessari per l’analisi dell’adenocarcinoma pancreatico, sia operabile che non operabile (metastatico e localmente avanzato) la raccolta e la processazione avvengono nell’ambito degli studi seguenti:

- GENOPAN (Studio sul profilo di espressione genica e genotyping di pazienti affetti da  adenocarcinoma del pancreas non operabile (localmente avanzato o metastatico),  Versione del 21/08/2012 (Versione del 12/04/2012 modificata in data 21/08/2012 in seguito ai chiarimenti richiesti dal Comitato Etico nella seduta del 15/05/2012) , Emendamento 01 del 22/01/2014).

 - GENOPAN II (Studio sul profilo di espressione genica e genotyping di pazienti affetti da adenocarcinoma del pancreas operabile Protocollo Versione 2 -Del 01/03/2013 (comprensiva di Emendamento 2), Emendamento 03 del 22/01/2014).

La tecnica utilizzata si avvale delle tecnologie di nuova generazione di sequenziamento massivo in parallelo dell'intero trascrittoma (RNAseq). Questa tecnologia di sequenziamento massivo del trascrittoma permette di identificare non soltato mutazioni puntiformi e traslocazioni, ma anche trascritti di fusione e forme di splice alternative.

Lo scopo è quello di individuare le tappe fondamentali del processo di cancerizzazione, gli elementi genetici di predittività di cancerizzazione, dell’andamento clinico e di sopravvivenza globale, ed in particolar modo di evidenziare quelle signature genetiche che distinguono le lesioni precancerose dall’adenocarcinoma del pancreas, allo scopo di individuare potenziali markers predittivi di diagnosi precoce.

Per quanto riguarda quei pazienti che verranno sottoposti ad intervento chirurgico resettivo, già previsto nell’ambito del normale percorso terapeutico, verrà prelevato un frammento di tessuto dal pezzo operatorio dopo ottenimento di regolare consenso informato. Questa procedura avverrà da tessuto fresco in sala prelievi dall’anatomo patologo, prima delle procedure di processazione del campione per la successiva analisi isto-patologica su tessuto conservato.

L’analisi genomica si propone di:

Obiettivo Primario:

1) Identificare differenti pattern molecolari e mutazioni puntiformi o riarrangiamenti genomici nelle lesioni precancerose dell’adenocarcinoma pancreatico, le IPMN. Questo consentirebbe di ottenere nuove informazioni sul processo cancerogenetico verso l’adenocarcinoma pancreatico per una diagnosi precoce ed una miglior conoscenza della storia naturale delle lesioni cistiche del pancreas, entità clinica di crescente incidenza, ma ancora poco conosciuta. Si precisa che per i tessuti necessari per l’analisi dell’adenocarcinoma pancreatico, sia operabile che non operabile (metastatico o localmente avanzato) la raccolta e la processazione avvengono nell’ambito degli studi seguenti:

- GENOPAN (Studio sul profilo di espressione genica e genotyping di pazienti affetti da  adenocarcinoma del pancreas non operabile (localmente avanzato e metastatico)),  Versione del 21/08/2012 (Versione del 12/04/2012 modificata in data 21/08/2012 in seguito ai chiarimenti richiesti dal Comitato Etico nella seduta del 15/05/2012) , Emendamento 01 del 22/01/2014.

 - GENOPAN II (Studio sul profilo di espressione genica e genotyping di pazienti affetti da adenocarcinoma del pancreas operabile Protocollo Versione 2 -Del 01/03/2013 (comprensiva di Emendamento 2), Emendamento 03 del 22/01/2014.

Obiettivi Secondari:

1) Identificare eventuali fattori molecolari predittivi di evoluzione maligna (da displasia a carcinoma invasivo). Ciò permetterebbe una miglior gestione clinica del paziente affetto da IPMN con importanti risvolti clinici sul trattamento e sul follow-up del paziente.

2) Identificare eventuali signature genetiche correlabili con la prognosi del paziente

 

Responsabile dello studio

  • Prof. Guido Biasco

Responsabile Studi di Patologia Pancreatica

  • Dott.ssa Mariacristina Di Marco

Responsabili Analisi di Laboratorio ed Elaborazione Dati

  • Dott.ssa Annalisa Astolfi
  • Dott.ssa Valentina Indio

Collaboratori

SSD Oncologia Medica Biasco

  • Dott.ssa Silvia Vecchiarelli
  • Dott.ssa Elisa Grassi

SSD Trapianti di Fegato Sama / Servizio di Ecografia

  • Dott.ssa Carla Serra

U.O Chirurgia Generale Minni

  • Prof. Francesco Minni
  • Prof. Riccardo Casadei
  • Dott. Claudio Ricci

U.O Chirurgia Generale Pinna

  • Prof. Antonio Daniele Pinna
  • Dott. Giorgio Ercolani

U.O Anatomia e istologia Patologica ff. Grigioni

  • Dott.ssa Donatella Santini

SSD Diagnostica Istopatologica e Molecolare degli organi solidi e del relativo trapianto – D’Errico

  • Prof.ssa Antonietta D’Errico

U.O Medicina Interna Corinaldesi

  • Dott. Raffaele Pezzilli

Bibliografia

  1. Zamboni G, Hirabayashi K, Castelli P, et al. Precancerous lesions of the pancreas. Best Pract Res Clin Gastroenterol 2013; 27:299-322
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